如图所示，CpB处理前后碱性峰均存在，且处理后碱性峰比例为7.8%，与处理前8.1%相比基本无差异，表明IgG1的C-末端Lys含量很少。
b. 细胞培养过程中铜离子浓度对IgG1抗体中碱性峰比例的影响
不同铜离子浓度下培养细胞生产抗体，抗体纯化后进行ICIEF检测，具体实验方法如下表：
培养容器 2L反应器 细胞株 (GS-) CHO-K1 基础培养基 CD培养基 培养时间 12天 铜离子浓度 400, 550, 750 and 1,000 nM 纯化方法 Protein A, 阳离子交换色谱、阴离子交换色谱上图结果显示，随着铜离子浓度增加，酸性峰基本保持不变，而碱性峰含量增加明显，表明铜离子浓度影响了IgG1中碱性异构体的比例。
实验2 碱性异构体的表征
a. 碱性异构体分离
对3个批次的不同产品进行了ICIEF 分析，结果显示除去这3种碱性异构体（B1，B2，B3片段）外，没有新的异构体产生（见下图A）。为进一步了解这3种异构体，选取批次1的产品，使用pH-IEC方法分离收集3个峰，将收集的样品浓缩后使用1xPBS（PH7.4）置换样品中的buffer，然后使用ICIEF 分析样品纯度。收集到的样品纯度约为：B1,28%； B2，76%； B3，76%。（见下图B）
b. 使用RP-HPLC-TOF/MS分析3种碱性异构体(B1-B3)
样品还原处理：使用缓冲液（50mMTri-HCl, 3M 胍盐酸盐，PH8.3）将样品稀释至1 mg/ml，添加0.5 M DTT至终浓度为50 mM，75°C 孵育 5 min，使用RP-HPLC -TOF/MS分析。
质谱结果显示这3种碱性异构体的轻链没有差异，但是重链差异明显。50,514 Da峰是理论重链峰，在50,514 Da峰前-57/58 Da处出现明显变化，推测-57/58 Da很可能是由于Pro酰胺化作用产生，据此推测B2只有一条重链发生了酰胺化，而B3的的两条重链均已酰胺化。结合B2和B3距离主峰的远近和B3的碱性强于B2，进一步印证了该结论。
c. 肽谱图分析3种碱性异构体(B1-B3)
为进一步确证B2和B3是由于Pro酰胺化造成的，将样品buffer置换为50 mM Tris-HCl（pH 8.3），然后按照1:10 (w/w)的比例将胰蛋白酶加入到样品中， 37°C 孵育4 h。取50μg经HPLC后进入质谱进行分析。
肽谱图显示，B1、B2和B3差异较大，尤其是在C-末端重链区。与C-末端SLSLPG肽链相比，B3的 SLSLP酰胺化肽链含量已经达到最高水平，相比B2只有大约一半的酰胺化肽段，结合B2和B3片段的高纯度和RP-HPLC-TOF/MS，进一步印证B2只有一条重链发生了酰胺化，而B3的的两条重链均已酰胺化。
此外，还有一些其他小的差异存在，见上面图谱中的数字箭头指示处，它们大多数是一些剪切下来的肽段，在B1、B2和B3中含量较高，见下表。峰2含有大量的片段，其中鉴定出来的一个片段包含有未被切除的N端信号肽序列Val-His-Ser (VHS)，该现象也曾有文献报道。峰3则可能是被胰蛋白酶水解时其中的糜蛋白酶活性非特异性裂解产生。B1中的峰5（上图未显示出来，洗脱峰在95min左右）则是来自重链的N端肽段环化，由于它在B1中的水平远高于B2和B3，说明环化的N端, 包含信号肽VHS的序列和一些剪切的片段是B1的主要成分。
实验3 12批中试条件（2L-2000L）下的产品中铜离子浓度与碱性峰百分比的线性分析
为验证该结果是否在规模放大时具有一致性，将工艺从2L放大到2000L。下图中样品来源于12个不同规模的反应器（2L-2000L)，工艺条件与之前铜离子实验尽可能保持一致。
上图的结果显示，其R2（0.54）明显低于小试中结果（图2，0.93），该结果表明：
在不同的培养规模，培养基中铜离子浓度对抗体的Pro酰胺化具有明显的影响；
工艺放大过程中，还有其他因素影响PRO的酰胺化。
讨论
讨论
酰胺化反应是由PAM的两个催化结构域PHM和PAL顺序催化完成。PAM位于亚细胞区，以可溶性和膜绑定方式存在。而这引发一个问题：酰胺化反应发生在细胞培养基中还是绑定在细胞膜上或是两者皆有？现已确定C末端Lys反应是在细胞培养基中进行。而紧邻Lys的Pro酰胺化反应尚未明确。
铜离子可以影响CHO细胞的一些功能，如低浓度可以提高细胞浓度和产量，高浓度可以降低蛋白聚集。然而过量的铜离子浓度则会促进有害自由基反应和影响PAM催化反应。