王云瑾等继续开发四重轮状病毒滴度检测qPCR，设计G1—G4型轮状病毒VP7基因特异性引物和探针，得到6组三重qPCR反应体系和1组四重qPCR反应体系。所建立的三重和四重qPCR中，除四重qPCR的G1型参数略低于要求外，其余标准曲线R2均>0.99，检测灵敏度达102拷贝/μl。多重与单重qPCR检测同一样本的相关性较好（R2>0.95）。三重与单重qPCR、四重与单重qPCR检测结果间具有良好的一致性，表明建立的多重qPCR可同时对3种以上目的基因进行分型和定量检测，为未来多价轮状病毒疫苗及混合病毒样本中毒株的快速分型和定量检测方法的建立提供了参考。之后通过实验发现轮状病毒复制过程中产生的mRNA是RT-qPCR的主要模板，引物和探针对mRNA序列具有特异性。不同孔和不同工作日的测定结果CV不超过6%，与CCID50的相对偏差小于5%。最后选取经Ⅲ期临床试验验证具有良好保护效果的同批次轮状病毒原液制备企业轮状病毒疫苗病毒滴度检测参考品，并对其进行病毒滴度标定。采用CCID50法结合ELISA检测结果显示，LD、LS和LH株单价轮状病毒参考品于4和25 ℃存放1、3、7 d及冻融1次均具有良好稳定性，而于37 ℃存放3、7 d对病毒滴度均有影响。于﹣60 ℃存放72个月仍具有良好的稳定性，试验间CV均≤15.06%。
刘悦越等针对VP7基因建立了一步法TaqMan探针RT-qPCR测定病毒滴度的方法，将轮状病毒样品系列稀释液接种到Vero细胞中，培养24 h后裂解细胞，并通过RT-qPCR检测效力。平行测定具有已知滴度（lgCCID50/ml）的参比标准品，并使用平行线法测定每个样品的效力，分别评估测定的特异性、精度和准确性。结果显示不同孔和不同工作日检测之间的CV不超过6%，测定结果与CCID50的CV小于5%。该检测是更加快速、经济高效、高通量的多价轮状病毒疫苗检测方法，无需病毒中和，可提高通量和缩短时间。
针对轮状病毒滴度的qPCR方法研究者进行了众多探索，目前已经针对G1—G4各种基因型建立了检测方法，可以有效检测轮状病毒滴度。
1.2
腮腺炎病毒
腮腺炎病毒为单负链RNA病毒。人对腮腺炎病毒普遍易感，也是唯一的宿主。Ammour等针对L-3型腮腺炎病毒设计引物探针，使用两步RT-qPCR法开发了病毒滴度检测方法，于5327—5567序列位点设计引物探针进行RT-qPCR检测。与传统的CCID50法进行对比，腮腺炎病毒滴度的检测范围为1.2~1.2×107CCID50/ml，使用该方法对病毒株进行6次重复试验，试验间CV为3.5%，试验内CV为3.1%，与CCID50方法对比，差异小于0.5 lgCCID50/ml，重复性检测CV小于15%。结果表明，该方法具有高效性以及高灵敏度，可以同时进行麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒的检测。
孟凡红等针对腮腺炎病毒的血凝素基因设计引物探针建立了一步TaqMan RT-qPCR的检测方法。以减毒活疫苗S79株作为参考品、Vero细胞作为细胞基质，确定病毒最佳感染时间为18 h；使用该方法检测灭活的腮腺炎减毒活疫苗、水痘病毒、狂犬病病毒、麻疹病毒、风疹病毒和Vero细胞，均无特异性曲线；2名操作人员于不同日期检测4个浓度样品的相对标准偏差均
